專利基本信息

一種高純度高車前素和澤蘭黃酮的制備方法

技術(shù)領(lǐng)域

[0001] 本發(fā)明屬于天然黃酮類物質(zhì)制備領(lǐng)域，特別涉及一種高純度高車前素和澤蘭黃酮 的制備方法。

背景技術(shù)

[0002] 荔枝草（Salvia plebeia R.Br.)系唇形科鼠尾草屬植物地上部分，又名蛤蟆草、 雪見草、過冬青等。一年生或二年生直立草本植物，全國分布于除西北以外的其它地區(qū)，主 產(chǎn)于江蘇，浙江，安徽等省。荔枝草粗提物對CCl4和D-GlaN誘發(fā)大鼠急性肝損傷有保護(hù)作 用，Oshima等發(fā)現(xiàn)荔枝草中的高車前素、高車前苷和澤蘭黃酮對CCl4和D-GlaN誘發(fā)大鼠肝 細(xì)胞毒性有保護(hù)作用（lmg/kg，p < 0. OOLFerrandiz等的研究表明高車前素對溴苯誘導(dǎo)的 老鼠肝損傷和肝脂質(zhì)過氧化有保護(hù)作用，在高劑量時(shí)對溴苯誘導(dǎo)的還原型谷胱甘肽缺失也 有抵抗作用，并推斷其保肝功能可能與抗氧化作用相關(guān)。曳野宏從荔枝草中分離了四種黃 酮類化合物，其中澤蘭黃酮、高車前素、高車前苷對肝中毒有顯著活性，澤蘭黃素沒有活性。 高車前苷對半乳糖胺肝細(xì)胞中毒的抑制作用也比對四氯化碳肝細(xì)胞中毒的抑制作用強(qiáng)。該 方法用傳統(tǒng)柱層析分離，成本高，重復(fù)性差，不適合規(guī)模生產(chǎn)。

[0003] 高車前素，澤蘭黃酮的結(jié)構(gòu)式如下：

[0004]

[0005] 1 R1 = H, R2 = H ； 3 R1 = OH, R2 = H ；

[0006] 2 R1 = H, R2 = Glu ；4 R1 = OH, R2 = Glu ；

[0007] 5 R1 = H, R2 = Glc

[0008] 1高車前素3澤蘭黃酮

[0009]高速逆流色譜技術(shù)(High-SpeedCountercurrent Chromatography, HSCCC)是近 30年發(fā)展起來的一種連續(xù)的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術(shù)， 其原理是利用螺旋柱在行星式的運(yùn)動時(shí)產(chǎn)生的離心力，使互不相溶的兩相不斷混合，同時(shí) 保留其中的一相（固定相），利用恒流泵連續(xù)輸入另一相（流動相），隨流動相進(jìn)入螺旋柱 的溶質(zhì)在兩相之間反復(fù)分配，按分配系數(shù)的次序，被依次洗脫。在流動相中分配比例大的 先被洗脫，反之，在固定相中分配比例大的后被洗脫。傳統(tǒng)的液相色譜技術(shù)進(jìn)行制備量分 離時(shí)，分配效率低，溶劑消耗量大，而且固態(tài)支持體或載體會帶來樣品被吸附、損耗和變性 等問題；而HSCCC能保證較高峰型分辨率，具有操作簡便，分離量大，樣品無損耗，分離效率 高，理論回收率為100%，重現(xiàn)性好和分離環(huán)境緩和等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、環(huán) 保等領(lǐng)域化學(xué)物質(zhì)的制備分離和純化。發(fā)明內(nèi)容

[0010] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題提供一種高純度高車前素和澤蘭黃酮的制備方法。該 方法明克服傳統(tǒng)分離技術(shù)的缺陷，采用高速逆流色譜法（HSCCC)制備天然異黃酮的方法， 該方法操作簡便，回收率高，分離量大。

[0011] 本發(fā)明的一種高純度高車前素和澤蘭黃酮的制備方法包括如下步驟：

[0012] (1)將A組分、B組分、C組分和D組分按體積比0.5-5 ： 0.5-5 ： 1-5 ： 2-10混 合后置于分液漏斗中，搖勻靜置分層，待平衡20-40分鐘后，將上相和下相分開，即得該溶 劑體系；其中A組分為二氯甲烷、三氯甲烷或四氯甲烷；B組分為三氯甲烷、四氯甲烷或正丁 醇；C組分為乙醇或甲醇；D組分為水；

[0013] (2)選擇上相為固定相，下相為流動相，先用固定相充滿逆流色譜儀柱子，調(diào)節(jié)主 機(jī)轉(zhuǎn)速為600-1000rpm，將流動相以0. 5-5. Oml/min的流速泵入柱內(nèi)，待整個(gè)體系建立動態(tài)

平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；

[0014] (3)根據(jù)檢測器紫外圖譜接收目標(biāo)成分，將流分進(jìn)行濃縮、結(jié)晶，得到高車前素和

澤蘭黃酮。

[0015] 上述溶劑體系優(yōu)選為三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水體系。

[0016] 所述步驟O)中所進(jìn)的樣品的制備方法為：將荔枝草提取物溶于上相和下相中。

[0017] 所述步驟（1)中的溶劑體系為二氯甲烷-三氯甲烷-甲醇-水，該四組分的體積 比依次為：0. 5 :4:3: 2;所述步驟O)中的主機(jī)轉(zhuǎn)速750rpm，流動相泵入柱內(nèi)的流速 為 4. Oml/min。

[0018] 所述步驟（1)中的溶劑體系為三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水，該四組分的體積 比依次為：1 :1:1: 7;所述步驟O)中的主機(jī)轉(zhuǎn)速850rpm，流動相泵入柱內(nèi)的流速為 5. Oml/min。

[0019] 所述步驟（1)中的溶劑體系為三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水，該四組分的體積 比依次為：4 ： 0.8 ： 4 ： 9;所述步驟O)中的主機(jī)轉(zhuǎn)600rpm，流動相泵入柱內(nèi)的流速為 1. Oml/min。

[0020] 所述步驟（1)中的溶劑體系為三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水，該四組分的體積 比依次為：5 ： 5 ： 4.5 ： 10;所述步驟O)中的主機(jī)轉(zhuǎn)速700rpm，流動相泵入柱內(nèi)的流速 為 2. Oml/mm。

[0021] 所述步驟（1)中的溶劑體系為三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水，該四組分的體積 比依次為：2 :3:1: 7 ；所述步驟O)中的主機(jī)轉(zhuǎn)速800rpm，流動相泵入柱內(nèi)的流速為 3. Oml/min。

[0022] 所述步驟（1)中的溶劑體系為三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水，該四組分的體積 比依次為：0. 8 :4:5: 8;所述步驟O)中的主機(jī)轉(zhuǎn)速lOOOrpm，流動相泵入柱內(nèi)的流速 為 4. Oml/min。

[0023] 所述步驟（1)中的溶劑體系為三氯甲烷-四氯甲烷-乙醇-水，該四組分的體積 比依次為：0. 5 :4:2: 6;所述步驟O)中的主機(jī)轉(zhuǎn)速950rpm，流動相泵入柱內(nèi)的流速 為 0. 5ml/min。

[0024] 所述步驟（1)中的溶劑體系為四氯甲烷-正丁醇-乙醇-水，該四組分的體積比依次為：3 ： 0.5 ： 1 ： 8;所述步驟O)中的主機(jī)轉(zhuǎn)速650rpm，流動相泵入柱內(nèi)的流速為 3. Oml/min。

[0025] 采用高速逆流色譜制備方法，它包括選擇構(gòu)成固定相，流動相的溶解體系；先用固 定相充滿逆流色譜儀柱子，調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速，將流動相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動態(tài)平衡 后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；根據(jù)檢測器紫外圖譜接收目標(biāo)成分。首先選擇一個(gè)溶劑體系的兩相組 合，溶劑體系由四個(gè)組分構(gòu)成。

[0026] 上述體系上相為固定相，下相為流動相。且經(jīng)一次分離得到高車前素和澤蘭黃酮 純品，純度在98%以上。

[0027] 實(shí)驗(yàn)條件適合溫度20_40°C，在上述溫度范圍內(nèi)，溫度較高時(shí)，出峰時(shí)間略有提前， 分離效果變化不大，對峰形無多大影響。

[0028] 主機(jī)轉(zhuǎn)速和流速需控制在一定范圍內(nèi)，按體積比將溶劑體系置于分液漏斗中，搖 勻靜置分層。待平衡一定時(shí)間后，將上相和下相分開，采用TBE-300B高速逆流色譜儀，該機(jī) 型柱體積為300ml，進(jìn)樣圈為20ml，配有TBP-50A泵，TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。 進(jìn)樣前，先用固定相充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為600-1000rpm，以0. 5-5. Oml/min的流 速將流動相泵入柱內(nèi)。

[0029] 分離和收集到的目標(biāo)成分，濃縮到一定純度后再進(jìn)行結(jié)晶得到單體。高純度是指 純度彡98%。

[0030] 本發(fā)明采用了高速逆流色譜分離技術(shù)克服了固態(tài)支持物或載體不可逆吸附、損耗 和變性，使被分離物回收率高理論達(dá)100%，本發(fā)明實(shí)際達(dá)到95%以上，又因?yàn)椴捎脙?yōu)選的 溶劑體系，控制實(shí)驗(yàn)條件溫度、調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速和流速的工藝條件，可以高效率的分離，獲得 高純度的高車前素和澤蘭黃酮（達(dá)到98%以上）。

[0031] 有益效果

[0032] 1、本發(fā)明采用了高速逆流色譜分離技術(shù)，保證較高峰形分辨度，分離量大、回收率 高、分離環(huán)境緩和、節(jié)約溶劑、操作簡便。

[0033] 2、本發(fā)明適合從各種工藝途徑制備的荔枝草提取物中獲得高純度的高車前素和 澤蘭黃酮（達(dá)到98%以上）。

具體實(shí)施方式

[0034] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。

[0035] 實(shí)施例1

[0036] 選取三氯甲烷-四氯甲烷-乙醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔 枝草黃酮類成分。實(shí)驗(yàn)條件適合溫度為25°C，先按0.5 :4:2: 6體積比將上述溶劑組 分分配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開。采用 半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進(jìn)樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵， TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。稱取IOOmg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下相 組成的溶液中待用。進(jìn)樣前，先用固定相充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為950rpm，以0. 5ml/min的流速將流動相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，然后根據(jù)檢測 器紫外圖譜，接收目標(biāo)成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮凍干后進(jìn)行結(jié)晶，其HPLC 純度達(dá)到98. 8%。

[0037] 實(shí)施例2

[0038] 選取四氯甲烷-正丁醇-乙醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔枝 草黃酮類成分。實(shí)驗(yàn)條件適合溫度為30°C，先按3 ： 0.5 ： 1 ： 8體積比將上述溶劑組分分 配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開。采用半制備 型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進(jìn)樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23 檢測器和N2000色譜工作站。稱取150mg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下相溶液中 待用。進(jìn)樣前，先用固定相充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為650rpm，以3. Oml/min的流速將 流動相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，然后根據(jù)檢測器紫外圖譜， 接收目標(biāo)成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮后進(jìn)行結(jié)晶，其HPLC純度達(dá)到98. 5%0

[0039] 實(shí)施例3

[0040] 選取二氯甲烷-三氯甲烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔 枝草黃酮類成分。實(shí)驗(yàn)條件適合溫度為22°C，先按0.5 :4:3: 2體積比將上述溶劑組 分分配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開。采用 半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進(jìn)樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵， TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。稱取150mg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下 相溶液中待用。進(jìn)樣前，先用固定相充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為750rpm，以4. Oml/min 的流速將流動相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，然后根據(jù)檢測器紫 外圖譜，接收目標(biāo)成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮后進(jìn)行結(jié)晶，其HPLC純度達(dá)到 99. 1%。

[0041] 實(shí)施例4

[0042] 選取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔 枝草黃酮類成分。實(shí)驗(yàn)條件適合溫度為40°C，先按1 :1:1: 7體積比將上述溶劑組分分 配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開。采用半制備 型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進(jìn)樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23 檢測器和N2000色譜工作站。稱取IOOmg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下相溶液中 待用。進(jìn)樣前，先用固定相充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為850rpm，以5. Oml/min的流速將 流動相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，然后根據(jù)檢測器紫外圖譜， 接收目標(biāo)成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮后進(jìn)行結(jié)晶，其HPLC純度達(dá)到99. 5%0

[0043] 實(shí)施例5

[0044] 選取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔 枝草黃酮類成分。實(shí)驗(yàn)條件適合溫度為20°C，先按4 ： 0.8 ： 4 ： 9體積比將上述溶劑組 分分配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開。采用 半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進(jìn)樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵， TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。稱取IOOmg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下 相溶液中待用。進(jìn)樣前，先用固定相充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為600rpm，以1. Oml/min 的流速將流動相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，然后根據(jù)檢測器紫外圖譜，接收目標(biāo)成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮后進(jìn)行結(jié)晶，其HPLC純度達(dá)到 98. 9%。

[0045] 實(shí)施例6

[0046] 選取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔 枝草黃酮類成分。實(shí)驗(yàn)條件適合溫度為25°C，先按5 ： 5 ： 4.5 ： 10體積比將上述溶劑 組分分配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開。采用 半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進(jìn)樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵， TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。稱取IOOmg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下 相溶液中待用。進(jìn)樣前，先用固定相充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為700rpm，以2. Oml/min 的流速將流動相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，然后根據(jù)檢測器紫 外圖譜，接收目標(biāo)成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮后進(jìn)行結(jié)晶，其HPLC純度達(dá)到 98%以上。

[0047] 實(shí)施例7

[0048] 選取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔 枝草黃酮類成分。實(shí)驗(yàn)條件適合溫度為32°C，先按2 :3:1: 7體積比將上述溶劑組分分 配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開。采用半制備 型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進(jìn)樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵，TBD-23 檢測器和N2000色譜工作站。稱取IOOmg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下相溶液中 待用。進(jìn)樣前，先用固定相充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為800rpm，以3. Oml/min的流速將 流動相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，然后根據(jù)檢測器紫外圖譜， 接收目標(biāo)成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮后進(jìn)行結(jié)晶，其HPLC純度達(dá)到98%以 上。

[0049] 實(shí)施例8

[0050] 選取三氯甲烷-四氯甲烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化荔 枝草黃酮類成分。實(shí)驗(yàn)條件適合溫度為35°C，先按0.8 :4:5: 8體積比將上述溶劑組 分分配置于分液漏斗中，振搖后靜置分層。待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開。采用 半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進(jìn)樣閥，柱容積為300ml，配有TBP-50A泵， TBD-23檢測器和N2000色譜工作站。稱取IOOmg荔枝草粗樣溶解于IOml上相和IOml下 相溶液中待用。進(jìn)樣前，先用固定相充滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為lOOOrpm，以4. Oml/min 的流速將流動相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，然后根據(jù)檢測器紫 外圖譜，接收目標(biāo)成分，得到高車前素和澤蘭黃酮流分，濃縮后進(jìn)行結(jié)晶，其HPLC純度達(dá)到 98%以上。