專利基本信息
| 申請?zhí)?/td> | CN200810037559.6 | 申請日 | 2008-05-16 |
| 公開（公告）號 | CN101580533A | 公開（公告）日 | 2009-11-18 |
| 申請公布號 | CN101580533A | 申請公布日 | 2009-11-18 |
| 分類號 | C07K1/16(2006.01)I | 分類 | 有機化學〔2〕 |
| 發(fā)明人 | 莊英萍;楊琪;郝玉有;儲炬;程杰;王維娜;符曉輝;張嗣良;王永紅 | 申請（專利權）人 | |
| 代理機構 | 上海專利商標事務所有限公司 | 代理人 | 華東理工大學;上海同田生物技術有限公司 |
| 地址 | 200237上海市梅隴路130號 | ||
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種高速逆流色譜分離重組人復合α干擾素(cIFN)異構體的方法，所述的高速逆流色譜條件為：將5-26％(w/w)聚乙二醇(PEG)，7-28％(w/w)無機或有機酸和其鹽，和余量的水混合、靜置得到雙水相體系，上相為固定相，下相為流動相，重量百分比是以所述的雙水相體系的總重量為基準；高速逆流色譜儀主機轉速為600-1200轉/分鐘；流動相流速為0.5-1.5ml/分鐘。 | ||
說明書
一種重組人復合a干擾素（cIFN)異構體的分離方法
技術領域
本發(fā)明涉及蛋白質的分離純化，尤其涉及一種重組人復合a干擾素（cIFN) 異構體的分離方法。
背景技術
重組人復合a干擾素（cIFN)是一種氨基酸序列重組的非天然存在的I 型a干擾素。集中了各種天然干擾素的優(yōu)點，具有更強、更廣譜的抗病毒作 用。體外抗病毒活性實驗證明，cIFN的抗病毒活性是其他兩種常用干擾素 (IFN-a2a、 IFN-a2b)的5-IO倍。在治療丙型肝炎上復合a干擾素的總治 愈率高達40%，并且對SARS表現(xiàn)出高度抗病毒活性。
正確構象的復合a干擾素單體蛋白含有兩對分子內二硫鍵，但是在cIFN 制備過程中，容易受到環(huán)境因素脅迫，而致使一條或兩條二硫鍵斷裂，二硫鍵 斷裂后的cIFN分子極不穩(wěn)定，常常形成低活性，甚至無活性的聚合體，聚合 體嚴重時在臨床上引起免疫原性。因此制備正確構象cIFN單體蛋白對于臨床 應用非常重要，對于研究制備過程中其發(fā)生聚合降解機理，實現(xiàn)優(yōu)化基因工程 菌表達調控策略和分離純化工藝具有十分重要的意義。但靠原有的一般分離手 段很難將其分開。
高速逆流色譜技術（HSCCC)建立在一種特殊的流體動力學平衡基礎上， 利用螺旋管的高速行星式運動產生的不對稱離心力場，保證兩相溶劑系統(tǒng)的有 效混合，分配和充分保留，從而實現(xiàn)物質在兩相溶劑中的高效分離。
雙水相聚合物分離體系，條件溫和（含水量高達70%—90%)，為蛋白質等 生物大分子的分離提供了一個理想而溫和的環(huán)境，特別適用于生物大分子，如 蛋白質、核酸和細胞粒子的提取和純化，并且傳質過程和平衡過程快速，易于 進行連續(xù)化操作，易于放大，使其在許多生物物質的分離純化中得到廣泛的應 用。雙水相體系（ATPS)應用于HSCCC中成為雙水相體系高速逆流色譜技術，它結合了兩者的優(yōu)點，在特殊的HSCCC儀器上可實現(xiàn)對生物大分子尤其是蛋白質 等的有效分離純化。
如今利用HSCCC對大分子活性物質分離已經取得了一些成果，如，細胞色 素c、肌紅蛋白、卵白蛋白和牛血紅蛋白四種標準蛋白的分離，雞白蛋白的分 離，但是將HSCCC運用于分離分子量僅差4個質子的cIFN異構體目前國內外 還沒有相關報道。
發(fā)明內容
本發(fā)明旨在提供一種有效分離cIFN兩種二硫鍵異構體混合物的方法。
本發(fā)明提供了一種高速逆流色譜分離重組人復合a干擾素（cIFN)異構體的 方法，所述的高速逆流色譜條件為：
將5—26y。(w/w)聚乙二醇（PEG) ， 7 — 28。/。(w/w)無機或有機酸和其鹽，和余量 的水混合、靜置得到雙水相體系，上相為固定相，下相為流動相，重量百分比是以 所述的雙水相體系的總重量為基準；
高速逆流色譜儀主機轉速為600—1200轉/分鐘；
流動相流速為0. 5 — 1. 5ml/分鐘。
在另一優(yōu)選例中，所述的聚乙二醇選自PEG1000、 PEG2000、 PEG4000、禾口/或 PEG6000。
在另一優(yōu)選例中，所述的聚乙二醇的分子量選自PEG2000、禾H/或PEG4000。 在另一優(yōu)選例中，所述的雙水相體系中含有l(wèi)—6%(w/w)PEG2000， 5 —
20%(w/w)PEG4000， 6—24%(w/w)無機或有機酸鹽，1 —4y。(w/w)無機或有機酸。
在另一優(yōu)選例中，所述的無機或有機酸和其鹽的酸根選自磷酸根、檸檬酸根;
金屬離子選自鈉離子、鉀離子。
在另一優(yōu)選例中，所述的高速逆流色譜儀主機轉速為750—1000轉/分鐘。 在另一優(yōu)選例中，所述的流動相流速為0. 6—1. 2ral/分鐘。 在另一優(yōu)選例中，所述的兩種二硫鍵異構體分別在雙水相體系中的分配系
數(shù)相差l一4倍。
在另一優(yōu)選例中，所述的兩種二硫鍵異構體分別在雙水相體系中的分配系 數(shù)通過高效液相色譜（HPLC)測定，或通過測定蛋白濃度確定。
4據(jù)此，本發(fā)明將HSCCC運用于分離分子量僅差4個質子的cIFN異構體。 附圖說明
圖1顯示了經本發(fā)明提供的高效逆流色譜技術分離前的cIFN異構體在 SDS-PAGE電泳和HPLC圖譜上的情況；條帶19KD位置上呈現(xiàn)兩條帶；
其中A是電泳圖，電泳圖中的l表示分子量標準、2表示cIFN異構體、a，b 分別為兩種cIFN單體蛋白條帶；B是反相高效液相色譜圖。
圖2顯示了 HPLC線性梯度優(yōu)化策略洗脫分離cIFN異構體的情況。
圖3顯示了實施例1中cIFN異構體HSCCC洗脫曲線；
其中I號洗脫峰為cIFN-A， II號洗脫峰為cIFN-B。
圖4顯示了實施例1中cIFN異構體經HSCCC分離得到的兩種單體cIFN的 HPLC檢測圖譜；
其中A表示實施例1中cIFN異構體，B表示圖3中的I號洗脫峰，C表示 圖3中的II號洗脫峰。
具體實施方式
發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)在一種雙水相體系中，cIFN的兩種異 構體在其兩相中的分配系數(shù)可以相差較大的倍數(shù)，從而使該雙水相體系作為高
速逆流色譜的固定相和流動相時，可以將cIFN的兩種異構體進行有效分離。
在本發(fā)明中，cIFN是一種氨基酸序列重組的非天然存在的I型a干擾素， 它可以通過本領域常規(guī)的方法獲得。
如本文所用，"重組人復合a干擾素(cIFN)異構體"是指一種混合物，它含有 兩種二硫鍵異構體，這兩種異構體中二硫鍵分別呈完整和斷裂兩種形式，化學性質 非常相似，分子量最多僅相差4個質子（含有兩對二硫鍵穩(wěn)定的cIFN分子量為 19300D)，在SDS-PAGE電泳圖上表現(xiàn)為兩條非?？拷逆⒚脦АＫ梢酝ㄟ^本領域 常規(guī)的方法得到，例如但不限于，畢赤酵母表達cIFN發(fā)酵上清液經聯(lián)合多種分離 純化方法（如：Hipr印疏水層析、Blue S印harose FF親和層析、S叩erdex 75凝 膠過濾層析等）制備得到的就是這種含有兩種二硫鍵異構體的混合物。
5在本發(fā)明中，高速逆流色譜（HSCCC)是指一種不用任何固態(tài)載體的液一液 色譜技術，是基于組分在旋轉螺旋管內的相對移動而互不混溶的兩相溶劑間分 布不同而獲得分離。
在本發(fā)明中，可以使用本領域熟知的商品化的高速逆流色譜儀，例如但不限于 美國Pharma Tech Research Corp.生產的CCC-1000和CCC-3000 ， Conway Centrichrom Inc.產生的DP-IOOO，英國Br匿l Institute of Bioengi匿ring(BIB) 產生的Brunei CCC，上海同田生物技術有限公司（Tauto Biotech Ltd.)生產的Tauto TBE-200V型，Tauto TBE-300V型。優(yōu)選上海同田生物技術有限公司（Tauto Biotech Ltd.)生產的Tauto TBE-200V型高速逆流色譜儀系統(tǒng)，所述的系統(tǒng)包括高速逆流色 譜儀的主機、柱溫控制裝置、泵液裝置、檢測裝置和結果處理裝置）；所述的主機 包括聚四氟乙烯管(直徑1. 8mm)纏繞在支架上形成多層螺旋管作為分離柱（柱容積 為200 mL)、進樣器、主機轉速控制裝置。TBE-200V型高速逆流色譜儀(上海同田 生化技術有限公司），聚四氟乙烯管(直徑1.8mm)纏繞在支架上形成多層螺旋管作 為分離柱位于恒溫夾套內，通過循環(huán)水浴(HX-1050，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司） 控制分離柱的溫度。進樣圈體積20mL。通過無級變頻調速控制主機轉速為 700-1000r/min。同時主機通過TBP-1002型泵（上海同田生化技術有限公司）進行 泵液，流出液用4波段UV檢測儀(上?？等A儀器廠)進行檢測，并連接浙大智達 N2000色譜工作站記錄檢測結果。
一般而言，HSCCC中流動相的流動方向和主機的旋轉方向都是可調的。在 本發(fā)明中，主機的旋轉方向規(guī)定為面對電機軸時順時針方向為正轉，由于電機 與主機是通過皮帶傳動，因此，二者的旋轉方向相同；將流動相從首端流入定 義為正向。
在本發(fā)明中，主機的旋轉方向和流動相的流動方向的組合可以有4種，包 括正向旋轉正向流動、正向旋轉反向流動、反向旋轉正向流動、和反向旋轉反 向流動。使用本發(fā)明優(yōu)選的上海同田生物技術有限公司(Tauto Biotech Ltd.)生產 的Tauto TBE-200V型高速逆流色譜儀系統(tǒng)進行重組人復合a干擾素（cIFN)異 構體的分離時，優(yōu)選高速逆流色譜儀反向旋轉，流動相反向流動。
在本發(fā)明中，高速逆流色譜設備主機的旋轉速度為600—1200轉/分鐘， 較佳地為750—1000轉/分鐘，更佳地為850 — 950轉/分鐘；流動相的流速為0. 5—1. 5ml/分鐘，較佳地為0. 6—1. 2ml/分鐘，更佳地為0. 7—1. Oml/分鐘。
在本發(fā)明中，高速逆流色譜分離時的色譜柱溫度為5 — 30。C，較佳地為10 一25。C,更佳地為15 —2CTC。
如本文所用，"雙水相"或"雙水相體系"是指在高速逆流色譜中互不混溶 的兩相溶劑都是水相，而沒有有機相?？梢允褂帽绢I域常用的方法配制雙水相 體系，例如但不限于按所用雙水相體系的組成稱取所需的成相聚合物和成相 鹽，將兩者分別溶于占所需量一半的蒸餾水中，充分混合，于分液漏斗中靜置 分相。靜置后會分成上、下兩相，其中上相也可以稱為高速逆流色譜中的固定 相，下相也可以稱為高速逆流色譜中的流動相。
如本文所用，"分配系數(shù)"是指待分離的樣品在雙水相體系的上、下兩相 中的濃度之比?？梢允褂帽绢I域熟知的方法獲得分配系數(shù)，例如但不限于HPLC 面積劃分法、和蛋白濃度測定法，較佳地為HPLC面積劃分法。
所述的HPLC面積劃分法是將待測樣品和雙水相體系混合、攪拌使所有固 體物完全溶解。靜置分相，分別取上、下相進樣，分別計算出上、下相中每個 峰的面積，則樣品中每個成分的分配系數(shù)K為：上相中該成分峰面積與下相中 該成分峰面積之比，即& Su/S,(下標U和L分別表示上、下相）。
所述的蛋白濃度測定法是利用Bradford考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。將 待測樣品和雙水相體系混合、攪拌使所有固體物完全溶解。靜置分相，分別取 上、下相用lcm光徑的比色杯測A595;以相同組成但不含蛋白質樣品的上、下 相加入到考馬斯亮藍溶液中作空白對照,用lcm光徑的比色杯測A595。計算分 配系數(shù)K， K定義為測得上、下相的吸光度之比，即！^AU/AL(下標U和L分別 表示上、下相）。
在本發(fā)明中，用Kl和K2分別表示cIFN異構體中兩種cIFN蛋白單體a, b 的分配系數(shù)。
在本發(fā)明中，所述的雙水相體系中含有成相聚合物和成相鹽，所述的成相 聚合物選自聚乙二醇（PEG)，優(yōu)選PEG，更優(yōu)選PEGIOOO、 PEG2000、 PEG4000、 和/或PEG6000;所述的成相鹽選自無機酸和/或其鹽、有機酸和/或其鹽，例如 磷酸、磷酸鹽、檸檬酸、檸檬酸鹽、硫酸、硫酸鹽、或其組合，優(yōu)選磷酸、磷 酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸 檸檬酸鉀、檸檬酸二鈉、檸檬酸三鈉、或其組合，更優(yōu)選檸檬酸三鈉和檸檬酸。本發(fā)明優(yōu)選的雙水相體系是使Kl和K2相差l一4倍的體系，更佳地是相 差1.5 — 3倍的體系。
本發(fā)明的雙水相體系優(yōu)選自PEG-檸檬酸鹽體系，以雙水相體系的總重量為 基準，其中含有10—18。/。(w/w)聚乙二醇（PEG) ， 10—18。/。(w/w)擰檬酸和其鹽， 以及余量的水；較佳地含有l(wèi) — 6%(w/w)PEG2000， 8—12%(w/w)PEG4000， 9一 15。/。(w/w)檸檬酸鹽，l一3y。(w/w)檸檬酸，以及余量的水；更佳地含有2 — 4%(w/w)PEG2000， 9—ll%(w/w)PEG4000， 10—13%(w/w)檸檬酸鹽，1.2 —3%(w/w) 檸檬酸，以及余量的水；所述的檸檬酸鹽優(yōu)選檸檬酸三鈉。
本發(fā)明的雙水相體系的pH在cIFN蛋白生物活性pH范圍內，即pH5-9，優(yōu) 選pH6-8。
主機轉速為800—1000轉/分鐘；流動相流速為0.6—1.2ml/分鐘。
本發(fā)明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所 揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何 可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特 征僅為均等或相似特征的一般性例子。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：
1、 首次運用雙水相高速逆流色譜將分子量僅相差4個質子的cIFN異構體 進行了有效分離；
2、 為蛋白質生物大分子的分離提供了一個理想而溫和的環(huán)境，比在HPLC 中利用有機溶劑分離好。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所 有的百分比和份數(shù)按重量計。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于 本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
8溶劑的配制
雙/大裙銀,游紀劍
根據(jù)所用雙水相體系的組成稱取所需的PEG和成相鹽，將兩者分別溶于占 所需量一半的蒸餾水中，充分混合，于分液漏斗中靜置分相，上下相分裝500ml 溶劑瓶，超聲，抽濾，待用。
分庸#/^游劍多
稱量一定量PEG和成相鹽，加入一定量的cIFN異構體樣品溶解使其組成 與所用分離體系相同（樣品本身是溶液狀，計算出比例，直接加入PEG和鹽就 可以），輕微攪拌使所有固體物完全溶解。
分配系數(shù)的測定
固定相：C4柱（Grace Vydac公司）
流動相：A相：水+0. 01%三氟乙酸（TFA) ， B相：60%乙腈+30%二氧六環(huán)+ 10% 水+0. 01%TFA;
梯度洗脫條件：B相濃度0-5分鐘，5%; 5-55分鐘，5%-60%; 55-60分鐘，60%。 雙水相體系中上相（又稱固定相）保留率的測定
將雙水相體系中的上相（固定相）充滿HSCCC分離柱，以一定的轉速和旋 轉方向運轉主機，同時以所需流速泵入雙水相體系中的下相（流動相），并收 集溢出口流出的固定相；流動相從溢出口穩(wěn)定流出時，記錄所排出的固定相體 積Ve。固定相保留率（R)定義為保留在分離柱內的固定相體積占分離柱總容積 (t)的比例，R=(Vt—Ve) / (Vt)。
高速逆流色譜分離操作
將雙水相體系中的上相（固定相）充滿HSCCC分離柱，并以一定的轉速和 旋轉方向運轉主機，同時以所需流速泵入雙水相體系中的下相（流動相）；流 動相從溢出口穩(wěn)定流出時，即表明分離柱內的兩相平衡已建立；經由進樣圈進 樣。
9髙速逆流色譜雙水相體系分離cIFN異構體
材料和方法
TBE-200V型高速逆流色譜儀，購自上海同田生物技術有限公司 cIFN異構體，將cIFN發(fā)酵上清液先經過離子交換層析，再經過疏水層析
制得。在SDS-PAGE條帶19KD位置上呈現(xiàn)兩條帶，HPLC上呈兩個峰，（見圖1)，
但質譜分析則為同一物質。
PEG2000、 PEG4000，檸檬酸三鈉，檸檬酸的來源如下：
名稱 來源
聚乙二醇（PEG) 上?；瘜W試劑公司
梓檬酸、檸檬酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀 上?；瘜W試劑公司
乙腈，二氧六環(huán)，甲醇，異丙醇，三氟乙酸等 國藥化學試劑有限公司
低分子量標準蚩門 饒那生物工程公司
配制雙水相體系：按質量比例3:10:12:2稱取PEG2000 36g, PEG4000 120g， 檸檬酸三鈉144g，檸檬酸24g，加純水876ml，超聲攪拌溶解，倒入2L分液漏 斗混合，靜置分相，取其上層溶液（上相）為固定相，下層溶液（下相）為流 動相，超聲，抽濾待用。
TBE-200V型高速逆流儀器，釆取反接反轉，調節(jié)主機轉速為880r/min， 流動相流速為0.8ml/niin，溫度控制在2(TC左右。在此條件下固定相保留率 =36. 7%。
上下相平衡后，開始進樣約4ml，樣品濃度為約0.3mg/ml，進樣后，在檢 測儀波長214nm下調零點與斜率，同時將連接的色譜工作站通道打開開始記錄。 分離結果如圖3所示。
將收集到的分離峰溶液轉移至透析袋中，在4C冰箱中進行反復透析和濃 縮，直到基本除去溶液中檸檬酸鹽，并濃縮到一定體積。利用建立的RP-HPLC 方法檢測分離前樣品及分離處理后的兩個洗脫峰。檢測結果如圖4所示，cIFN 制備品種中兩個單體含量分別約為55%和28%，經過HSCCC分離后，I號洗脫 峰純度為99.4%(b)，回收率達到90.9%; II號洗脫峰純度為98.6%(c)，回收率達到92. 3%。
實施例2
高速逆流色譜雙水相體系分離cIFN異構體
材料和方法
TBE-200V型高速逆流色譜儀，購自上海同田生物技術有限公司 cIFN異構體，將cIFN發(fā)酵上清液先經過離子交換層析，再經過疏水層析
制得。在SDS-PAGE上呈現(xiàn)兩條帶，HPLC上呈兩個峰，（見圖1)，但質譜分
析則為同一物質。
PEG2000、 PEG4000，檸檬酸三鈉，檸檬酸，它們的來源同實施例1中所述。
采用TBE-200V型高速逆流儀器，配有恒流泵，15ml進樣閥，聚四氟乙烯 柱，柱體積為200ml， UV紫外檢測器。按質量比例1:8:9:1稱取PEG2000 12g， PEG4000 96g，檸檬酸三鈉108g，檸檬酸12g，加純水972ral，超聲攪拌溶解， 倒入2L分液漏斗混合，靜置分相，取其上層溶液（上相）為固定相，下層溶 液（下相）為流動相，超聲，抽濾待用。
先用固定相充滿整個柱體，然后開啟高速逆流色譜儀，采取反接反轉，調 節(jié)主機轉速為800r/min，流動相流速為1. 2ml/min，溫度控制在2(TC左右。待 整個體系建立動態(tài)平衡后，稱量PEG2000 0. 07g， PEG4000 0. 55g，檸檬酸三鈉 0. 62g，檸檬酸O. 70g，以5ml樣品溶解，由進樣閥進樣，在檢測儀波長214nm 下調零點與斜率，然后根據(jù)檢測器紫外譜圖，分別收集cIFN-A、 cIFN-B。
將收集到的分離峰溶液凍干制備蛋白質或轉移至透析袋中，在4'C冰箱中 進行反復透析和濃縮，直到基本除去溶液中檸檬酸鹽，并濃縮到一定體積。
經建立的HPLC分析，可以獲得同實施例1相似純度的cIFN-A和cIFN-B。
實施例3
高速逆流色譜雙水相體系分離cIFN異構體
材料和方法
TBE-200V型高速逆流色譜儀，購自上海同田生物技術有限公司cIFN異構體，將cIFN發(fā)酵上清液先經過離子交換層析，再經過疏水層析 制得。在SDS-PAGE上呈現(xiàn)兩條帶，HPLC上呈兩個峰，（見圖1)，但質譜分 析則為同一物質。
PEG2000、 PEG4000，檸檬酸三鈉，檸檬酸，它們的來源同實施例1中所述。
釆用TBE-200V型高速逆流儀器，配有恒流泵，15ml進樣閥，聚四氟乙烯 柱，柱體積為200ml, UV紫外檢測器。按質量比例6:12:15:3稱取PEG2000 72g, PEG4000 144g，檸檬酸三鈉180g，檸檬酸36g，加純水768ml，超聲攪拌溶解， 倒入2L分液漏斗混合，靜置分相，取其上層溶液（上相）為固定相，下層溶 液（下相）為流動相，超聲，抽濾待用。
先用固定相充滿整個柱體，然后開啟高速逆流色譜儀，釆取反接反轉，調 節(jié)主機轉速為1000r/min，流動相流速為0. 6ml/min，溫度控制在2(TC左右。 待整個體系建立動態(tài)平衡后，稱量PEG2000 0. 41g， PEG4000 0.821g，檸檬酸 三鈉1.028g，檸檬酸0.206g，以5ml樣品溶解，由進樣閥進樣，在檢測儀波 長214nm下調零點與斜率，然后根據(jù)檢測器紫外譜圖，分別收集cIFN-A、cIFN-B。
將收集到的分離峰溶液凍干制備蛋白質或轉移至透析袋中，在4'C冰箱中 進行反復透析和濃縮，直到基本除去溶液中檸檬酸鹽，并濃縮到一定體積。
經建立的HPLC分析，可以獲得同實施例1相似純度的cIFN-A和cIFN-B。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻 被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，
本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申 請所附權利要求書所限定的范圍。
