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說明書

高速逆流色譜制備紅霉素A、紅霉素B、紅霉素C的方法

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種從紅霉素原料中制備高純度紅霉素A、紅霉素B、紅霉素C的方法，特別是涉及一種采用高速逆流色譜制備高純度紅霉素A、紅霉素B、紅霉素C的方法。

背景技術(shù)

紅霉素(Erythromycin，簡稱EM)是一種大環(huán)內(nèi)酯類廣譜抗生素。目前已知其中有六種異構(gòu)體，分別為紅霉素A， B， C, D， E和F, A為主要活性成分。紅霉素B和紅霉素C的理化性質(zhì)及抗菌譜與紅霉素A相似，但它們的抗菌活性一般只有紅霉素入的30°/『60%。因此，目前醫(yī)療上用的大部分是紅霉素A。

高純度的紅霉素組分的樣品對于各種有關(guān)紅霉素的研究工作都有著十分重要的意義。

紅霉素A與紅霉素B 、紅霉素C的性質(zhì)相似， 一般的分離手段很難將其分離開來。高速逆流色譜（High Speed Counter Current Chromatography, HSCCC)是1980年推出的一種無需固體支撐物的高效液液分配色譜分離技術(shù)，以其高回收率、高制備能力和高富集能力成功地運用于生物化學、生物工程、醫(yī)學、藥學、天然產(chǎn)物化學、有機合成、化工、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、材料等領(lǐng)域。高速逆流色譜技術(shù)溫和而有效的分離使得其在分離抗生素的領(lǐng)域得到了廣泛的應用，尤其在制備抗生素標準品方面顯得很有潛力。

在采用高速逆流色譜分離制備紅霉素組分的研究工作中，Booth等人采用高速逆流色譜在溶劑系統(tǒng)為：正己垸:乙酸乙酯:甲醇:水=1.4:2.0:2.0:1.0，理論塔板數(shù)不高于1219的情況下分離制備紅霉素A，得到了純度在97%以上的紅霉素八【1]'P]. [3] 。 ([i] A丄Booth， GJ.Lye. Optimization of the fractionation and recovery ofpolyketide antibiotics by countercurrent chromatography. J.Liq. Chromatogr.Rel.Technol.， 2001, 24(11&12):1841-1861

[2] A丄Booth， I.A.Sutherland, GJ.Lye. Modeling the performance of pilot-scalecountercurrent chromatography: Scale-up predictions and experimental verificationof erythromycin separation. Biotechnology and Bioengineering, 2003, 81(6):640 -649

[3] A丄Booth, S.H.Ngiam, GJ.Lye. Antibiotic purification from fermentation brothsby counter-current chromatography: analysis of product purity and yield trade-offs.Bioprocess and Biosystems Engineering, 2004, 27:51-61 )。而目前尚未見采用高速逆流色譜分離制備高純度紅霉素B、 C的研究報道，國內(nèi)也尚未有高純度的紅霉素B和紅霉素C樣品提供。發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種從紅霉素原料中制備高純度紅霉素A、紅霉素B和紅霉素C的方法。本方法可以同時或分別制備紅霉素A、紅霉素B和紅霉素C。

本發(fā)明采取以下的技術(shù)方案： 一種采用高速逆流色譜制備高純度紅霉素A、紅霉素B、紅霉素C的方法，包括：由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水配制構(gòu)成固定相、流動相的溶劑體系，上相為固定相，下相為流動相，使逆流色譜儀整個柱體中充滿固定相，再將流動相泵入柱內(nèi)；將含有紅霉素組分A、 B、 C的紅霉素原料溶于下相溶劑中，由進樣閥進樣，根據(jù)檢測器的紫外譜圖分別接收目標組分紅霉素A、紅霉素B、紅霉素C，并進行冷凍干燥，其特征在于，所述的溶劑體系中正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的用量體積比為0.5?1.3: 0.5?2.0: 0.5~2.0: 1。

其中，所說的紅霉素原料為岳陽同聯(lián)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的紅霉素堿，生產(chǎn)批號為20060710。

在上述溶劑體系中，所述的溶劑體系中正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的用量體積比為0.6?1.2: 1.0~2.0: 0.8~1.6: 1時，得到的紅霉素A的純度高達

90%~訓％;

所述的溶劑體系中正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的用量體積比為0.6-1.2:0.8-2.0: 0.8~1.6: 1時，得到的紅霉素B的純度高達80%~100%;

所述的溶劑體系中正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的用量體積比為0.6-1.2:L0?2.0: 0.8~1.2: 1時，得到的紅霉素C的純度高達70%~95%。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：1.本方法中采用了高速逆流色譜分離方法，高速逆流色譜技術(shù)避免了因吸附作用引起的樣品損失、樣品組分的化學變性，分離效能與容量可以與制備HPLC相比，而且一般不存在峰的拖尾現(xiàn)象。2.在本方法中在所述的溶劑系統(tǒng)下采用高速逆流色譜分離制備紅霉素A、紅霉素B、紅霉素C時，可根據(jù)需要同時或分別制備紅霉素A、紅霉素B、紅霉素C; 3、本方法分離制備紅霉素A、紅霉素B、紅霉素C，的有效理論塔板數(shù)為1300?2500，具有分離高效、快速、分離量大、樣品無損失、回收率高、分離環(huán)境溫和、節(jié)約溶劑等特

具體實施方式

為更好理解本發(fā)明，下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明，但所舉的實施例并不限制本發(fā)明的保護范圍：實施例1

使用半制備型高速逆流色譜儀，配有恒流泵，15ml進樣閥，聚四氟乙烯柱，柱體積為200ml， UV紫外檢測器。將體積比為1.2:2:1.2:1的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混溶于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，取其上層溶液（上相）為固定相，下層溶液（下相）為流動相，超聲脫氣后，先用固定相充滿整個柱體，然后開啟高速逆流色譜儀，調(diào)整主機轉(zhuǎn)速為900rpm，以L3mVmin的流速將流動相泵入柱內(nèi)，待整個體系建立動態(tài)平衡后，將100mg的紅霉素原料溶于3ml的下相中，由進樣閥進樣，然后根據(jù)檢測器紫外譜圖，分別收集紅霉素A、紅霉素B、紅霉素C組分峰，吹出其中的有機溶劑，冷凍干燥，得到白色紅霉素固體，經(jīng)HPLC分析，紅霉素A純度為99.87%,紅霉素B純度為92.09%，紅霉素C純度為卯.24%，其中分離紅霉素A的有效理論塔板數(shù)為2116，分離紅霉素B的有效理論塔板數(shù)為1898，分離紅霉素C的有效理論塔板數(shù)為1764。

實施例2

使用半制備型高速逆流色譜儀，配有恒流泵，15ml進樣閥，聚四氟乙烯柱，柱體積為200ml， UV紫外檢測器。將體積比為0.6:1.2:1:1的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水混溶于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，取其上層溶液（上相）為固定相，下層溶液（下相）為流動相，超聲脫氣后，先用固定相充滿整個柱體，然后開啟高速逆流色譜儀，調(diào)整主機轉(zhuǎn)速為900rpm，以1.3ml/min的流速將流動相泵入柱內(nèi)，待整個體系建立動態(tài)平衡后，將100mg的紅霉素原料溶于3ml的下相中，由進樣閥進樣，然后根據(jù)檢測器紫外譜圖，分別收集紅霉素A、紅霉素B、紅霉素C組分峰，吹出其中的有機溶劑，冷凍干燥，得到白色紅霉素固體，經(jīng)HPLC分析，紅霉素A純度為99.6P/。，紅霉素B純度為99.03。/。，紅霉素C純度為81.20。/0，其中分離紅霉素A的有效理論塔板數(shù)為1393，分離紅霉素B的有效理論塔板數(shù)為2401，分離紅霉素C的有效理論塔板數(shù)為1600。